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技术支持

怎样从总rna中进行mrna的分离和纯化
发布时间:2019-05-23   点击次数:129次

      真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物,因此,高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5?g RNA,理论上认为每克细胞可分离出5~10mg RNA。其中 rRNA为75%~ 85%,tRNA占10%~16%,而mRNA仅占1%~5%,并且mRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,表达丰度也不一样。
       真核生物mRNA有特征性的结构,即具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly(A)尾,通常用poly(A+)表示,这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
       一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚(dT)(即oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,即可得到较纯的mRNA。
目前常用的mRNA的纯化方法有:
(1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法;
(2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;
(3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。
本实验应用方法(1)进行mRNA的分离纯化。
【试剂与器材】
(一)试剂
1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL
2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素
3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4. 洗涤缓冲液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。
5. 5 mol/L NaCl,每组10mL
6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL
7. 无RNase双蒸水(DEPC水),每组100mL
8. 70%乙醇,每组10mL
注意:溶液5,6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1,3,4,8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,最hao能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。
(二)器材
1. 恒温水浴箱
2. 冷冻高速离心机
3. 紫外分光光度计
4. 巴斯德吸管
5. 玻璃棉
6. 5ml一次性注射器
【操作方法】
(一) oligo(dT)纤维素的预处理
1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2. 将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0mL,用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。
3. 用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素,直到流出液的pH值小于8.0。
4. 将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出,用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮,浓度约为0.1g/mL,保存在4℃待用。
(二) 总RNA浓度的调整
1. 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中,如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL,则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL,总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟,然后迅速插在冰上冷却。
2. 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。
(三) mRNA的分离
1. mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合:用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素,按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中,盖上盖子,颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。
总RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纤维素(mL)洗涤缓冲液1,2 (mL)洗脱体积(mL)
<0.20.21.01.0
0.2-0.50.51.51.5
0.5-1.01.03.03.0
1.0-2.02.05.05.0

2. 转移:取1个5ml的一次性注射器,取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端,并把它固定在无RNase的支架上,再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器,推进塞子直至底部,把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中(保留至确定获得足够的mRNA)。
3. 洗涤:根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1,温和振荡,充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子,用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时准备洗脱。
4. 洗脱:根据上表直接用注射器慢慢吸取适量(2-3倍柱床体积)的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
5. 测定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脱液组分于4℃,2500g,离心2-3分钟,上清转移至新的离心管中,去掉残余的oligo(dT)-纤维素。
6. 沉淀:洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.2), 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀后,-20℃30分钟或放置过夜。
7. 离心收集:12000g, 4℃离心15分钟,小心弃去上清,mRNA沉淀此时往往看不见,用70%乙醇漂洗沉淀,12000g, 4℃离心5 分钟,小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水,立即用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
8. 定量:测定OD260和OD280,计算产率以及OD260/OD280的比率(同上一实验)。
【注意事项与提示】
1. 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
2. 提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量的先决条件。
3. 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA不纯。
4. RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5 分钟,这一步很重要,其作用(1)破坏mRNA的二级结构,特别是poly(A+)尾处的二级结构,使poly(A+)尾充分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;(2)解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
5. 应注意mRNA不能被DNA污染,即使是1 ppm DNA污染,也可严重影响实验结果。
6. mRNA制备后,可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状,无明显区带,但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内。一般来说,经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留,但一般来说不会对后续实验造成很大的影响,如果样品充足,可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次,进一步提高其纯度。
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝脏总 RNA;
Lane 3, 老鼠肝脏mRNA
7. 为防止mRNA降解,应避免多次冻融,可将mRNA少量分装后保存。另外,如果有低温冰箱,最hao在 -70℃~ -80℃保存。 也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8. 寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH、灭菌 ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
9. 一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
【实验安排】
1. 第一天:试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理(0.1%DEPC浸泡或高温干烤)。
2. 第二天:进行(一)、(二)和(三)1-6。
3. 第三天:进行(三)7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA。
4. 为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解,最hao能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。
 

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